果胶裂解酶（pectinate lyases，PL）试剂盒说明书

注 意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：
果胶裂解酶（EC4.2.2.10）是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁，导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶，来源比较广泛，主要来源于微生物，可用于果汁、果酒的澄清，提高水果出汁率，植物病毒的纯化，纸浆的漂白和纺织品的生物精炼，在减少环境污染和降低能源消耗方面具有潜在的应用价值。

测定原理： 

果胶裂解酶作用于果胶中的 α-1,4 糖苷键，生成在还原端 C4 和 C5 之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在 235nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
1．组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2．细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液：直接测定。
测定操作表：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 235nm，蒸馏水调零。
2、 操作表

酶活性计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 组织中 PL 活性
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 64.1×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 64.1×△A÷W
2. 细菌、真菌 PL 活性
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每 104个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/104cell）= △A ÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 64.1×△A÷细胞数量
3. 培养液 PL 活性
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 64.1×△A
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.2mL；
V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1. 组织中 PL 活性
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 128.2×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 128.2×△A÷W
2. 细菌、真菌 PL 活性
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每 104个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min/104cell）=△A÷（ε×d）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T
 = 128.2×△A÷细胞数量
3. 培养液 PL 活性
酶活性定义：在 40℃，pH5.5 条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性（nmol/min//mL）= △A÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 128.2×△A
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min

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