吲哚乙酸氧化酶活性测定试剂盒说明书

注 意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。

测定原理：

在无机酸存在情况下，吲哚乙酸能与 FeCl3 作用，生成红色螯合物，该物质在 530nm 处有 吸收峰，酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。
自备仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、1.5mL 离心管、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂六：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。临用前吸取 1mL 试剂五加入试剂六中混匀，待用，避光保存
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 530 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二、试剂三、试剂四置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 20min。
3. 取 1.5mL EP 管若干，按操作依次加入试剂，操作表如下：

IAA 氧化酶活性计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
IAA 标准曲线公式：y = 1.334x + 0.025 R2 = 0.998 （x 为 IAA 浓度，mmol /L；y 为吸光值）
（1） 按蛋白浓度计算
酶活定义：从开始时加入的 IAA 量减去酶作用后残留的 IAA 含量，即得被酶所催化的 IAA 含量。以每 mg酶蛋白在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷（V 样×Cpr）÷T=1.5×（A1-A2）÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
酶活定义：以每 g 样本在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/g 鲜重）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=1.5×（A1-A2）÷W
（3） 按细胞数量计算
酶活定义：以每 1 万个细胞在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=1.5×（A1-A2）÷细胞数量
（4） 按液体体积计算
酶活定义：以每 mL 酶液在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总) ÷T=1.5×（A1-A2）

V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g，T：反应时间，0.5h。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
IAA 标准曲线公式：y = 0.667x + 0.025 R2 = 0.998 （x 为 IAA 浓度，mmol /L；y 为吸光值）
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：从开始时加入的 IAA 量减去酶作用后残留的 IAA 含量，即得被酶所催化的 IAA 含量。以每 mg酶蛋白在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。U（μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V 样÷（V 样×Cpr）÷T=3×（A1-A2）÷Cpr（2）按样本鲜重计算
酶活定义：以每 g 样本在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/g 鲜重）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=3×（A1-A2）÷W
（3）按细胞数量计算
酶活定义：以每 1 万个细胞在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/104 cell）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=3×（A1-A2）÷细胞数量
（4）按液体体积计算
酶活定义：以每 mL 酶液在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。
U（μmol/h/mL）=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V 样÷(V 样÷V 样总) ÷T=3×（A1-A2）
V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g，T：反应时间，0.5h。
注意事项：
检出限为 0.01μmol/mL。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。