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转氢酶-2测试盒/分光光度法
物品单位 价格 品牌
567 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:50管/48样
  • 货号:LM-876299S
  • 发布日期: 2022-11-08
  • 更新日期: 2022-11-08
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876299S
用途范围 NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+还原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收,测定375nm光吸收的增加速率,来计算TH-2活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 50管/48样
是否进口

线粒体转氢酶-2(TH-2)试剂盒说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
TH 位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化 NADH+NADP+和 NAD++NADPH 相互转化,调 节 线 粒 体  nad(h) 和  nadp (h) 平 衡。把逆向反应称为 TH-2,催化 NADPH 和 NAD+生成 NADP+和 NADH。

测定原理:

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收,因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代 NAD+,TH-2 催化 APAD+还原生成 APADH,APADH 在 375nm 有特征光吸收,测定 375nm 光吸收的增加速率,来计算 TH-2 活性。

需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
试剂一:液体 50mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 25mL×2 瓶,4℃保存;
试剂四:粉剂×2 支,-20℃保存;
试剂五:粉剂×2 支,-20℃保存;

样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 500uL 试剂二,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 TH-2 活性测定。

测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 375nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支,将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 样本和 1000μL 工作液,混匀,立即记录 375nm 处初始吸光值 A1和 10min 后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

TH-2 活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T=164×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=82×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。
TH-2 活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.164×ΔA
V 反总:反应体系总体积,1.1×10-3L;ε:APADH 摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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