Ca++ Mg++- ATP 酶活性测定说明书

注 意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Na+K+- ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。

测定原理：

Na+K+-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷，通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性。

需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL ×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 6mL 蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水， 4℃保存。
试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂六：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂七：液体 25mL×1 瓶，室温保存。
试剂八：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂八 20 倍稀释，即取 0.1mL 试剂八加 1.9mL 蒸馏水充分混匀。定磷剂的配制：按 H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂 用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）

注意：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒 100 管保证测 48 份 Na+K+-ATP 酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3、空白管和标准管只要做一管。
计算 ：
1、血清（浆）Na+K+- ATPase 活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP 酶活力（μmol/h/mL）=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷V 样÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）
2、组织、细菌或细胞中 Na+K+- ATPase 活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /mg prot)=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷（Cpr×V 样）÷T =7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中 Na+K+-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /g 鲜重)=[ C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(W× V 样÷V 样总)÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每 1 万个细菌或细胞中 Na+K+-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /104 cell) =[ C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.015×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.25mL；V 样：加入样本体积，0.1mL ；
V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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