线粒体复合体Ⅲ试剂盒说明书

注 意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称 CoQ-细胞色素 C 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型 CoQ 的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素 C。

测定原理：

与氧化型细胞色素 C 不同，还原型细胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收，因此 550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂六：液体 2.5mL×1 瓶，-20℃保存；

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做）。
5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅲ酶活性测定。

测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：将试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、25μL 试剂六和 200μL 工作液，立即混匀，记录550nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
复合体Ⅲ活力单位的计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=615×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=124×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.248×ΔAV 反总：反应体系总体积，2.35×10-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1230×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=248×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.496×ΔAV 反总：反应体系总体积，2.35×10-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

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