线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书

注 意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶 Q 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基 FAD 还原为 FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶 Q 生成还原型辅酶 Q，是呼吸电子传递链的支路。


测定原理：

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶 Q 可进一步还原 2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在 605nm 有特征吸收峰，通过检测 2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。
 
需自备的仪器和用品： 
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂组成和配制： 
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂六：液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存；
 
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）。
5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅱ酶活性测定。
 
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、25μL 试剂六和 200μL 工作液，立即混匀，记录605nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
复合体Ⅱ活力单位的计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=113×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =0.226×ΔAV 反总：反应体系总体积，2.35×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=1118×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=226×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.452×ΔAV 反总：反应体系总体积，2.35×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。