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线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒/分光光度法
物品单位 价格 品牌
1660 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:25管/12样
  • 货号:LM-876314S
  • 发布日期: 2022-11-08
  • 更新日期: 2022-11-08
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-876314S
用途范围 复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
纯度 99%
CAS编号
规格 25管/12样
是否进口

线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理:

复合体Ⅴ水解 ATP 产生 ADP 和 Pi,通过测定 Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
 
需自备的仪器和用品: 
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制: 
试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:1 mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前每支加入 1.3mL 蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂五:6mL×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 3mL 蒸馏水,充分混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂七:粉剂×1 瓶, 4℃保存;临用前加入 10mL 蒸馏水,充分混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂八:粉剂×1 瓶, 4℃保存;临用前加入 10mL 蒸馏水,充分混匀;溶解后 4℃保存一周;
试剂九:液体 10mL×1 瓶,室温保存。
定磷试剂的配制:按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂 用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。
样本的前处理: 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 800uL 试剂二和 8uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于复合体Ⅴ酶活性测定。
测定步骤: 
2022110809254964256

复合体Ⅴ活性计算:
标准条件下测定的回归方程为 y = 1.274x + 0.004;x 为标准品浓度(mmol/L),y 为 A 值。
1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T =50.7×(ΔA-0.004) ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性(nmol/min /104 cell)=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.101×(ΔA-0.004)

V 反总:反应体系总体积,3×10-4 L; V 样:加入样本体积,0.125 mL;V 样总:加入提取液体积,0.808mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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