线粒体转氢酶-1（TH-1）试剂盒说明书

注 意 ：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
TH 位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六，催化 NADH+NADP+和 NAD++NADPH相互转化。催化正向反应称为 TH-1。线粒体 NADH 含量增加时会导致线粒体膜的 H+电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上 ROS 的产生。TH-1 促进 NADH 转换为 NADPH，从而提高线粒体的抗氧化能力。


测定原理：

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。
用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP+）替代 NADP+，TH-1 催化 APADP+还原生成的 APADPH 在 375nm 有特征光吸收，因此通过测定 375nm 光吸收增加速率，来计算 TH-1 活性。
 
需自备的仪器和用品： 
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制： 
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 18mL×1 瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（此步可选做）。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-1 活性测定。
测定步骤： 
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 375nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μL 样本和 180μL 工作液，混匀，立即记录 375nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
TH-1 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=74.5×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.149×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=149×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.298×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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