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线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH辅酶Q还原酶测试盒/分光光度法
物品单位 价格 品牌
1560 联迈生物
  • 产地:上海
  • 型号:25管/24样
  • 货号:LM-892752S
  • 发布日期: 2022-11-08
  • 更新日期: 2022-11-08
产品详细说明
产地 上海
品牌 联迈生物
货号 LM-892752S
用途范围 复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
纯度 99%
CAS编号
规格 25管/24样
是否进口

线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书

注 意 :正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中 的蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH 传递给 CoQ,同时可使 O2 还原生成 O2.-,是呼吸电子传递链上产生 O2.-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。


测定原理:

复合体Ⅰ能够催化 NADH 脱氢生成 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶活性的大小。

需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:
试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:0.5 mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:25mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂五:1 mL×1 支,-20℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 2mL 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于复合体Ⅰ酶活性测定。

测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。
(2)在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 样本、800μL 工作液和 60μL 试剂六,立即混匀,记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算
(1)按蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=365×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.73×ΔAV 反总:反应体系总体积,9×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。

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