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- 品牌:联迈生物
- 产地:中国/上海
- 型号:50次
- 货号:LM815-4540K
- 价格: ¥4490/盒
- 发布日期: 2022-11-07
- 更新日期: 2024-04-19
产地 | 中国/上海 |
品牌 | 联迈生物 |
货号 | LM815-4540K |
用途范围 | 仅供科研 |
纯度 | % |
规格 | 50次 |
Tobacco Mosaic Virus(TMV)烟草花叶病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品及特点
1.即开即用,用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化,分析灵敏性高。
3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物和探针是根据烟草花叶病毒RNA高度保守区设计,不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
本产品只能用于科研。
规格及成分
使用方法
一、稀释标准曲线样品(以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传 染 性 病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传 染 性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光RT-PCR专用模板稀释液, 用带芯枪头,下同)。
在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分
3.震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头,在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
7.如果有N个样品, 设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNAout。
三、Probe qRT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个RT-PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复,则标记N+4个RT-PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板),1个用于RT-PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后 加):
成分 |
样品管 N+2个 |
RT-PCR阴性对照 |
标准曲线样品管 (1-6管) |
2×Probe qRT-PCR MagicMix |
各10 μL |
10 μL |
各10 μL |
烟草花叶病毒RT-PCR 引物-探针混合液 |
各3 μL |
3 μL |
各3 μL |
N+2个待测RNA样本 |
各7 μL |
不加 |
不加 |
超纯水 |
不加 |
7 μL |
不加 |
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号) |
不加 |
不加 |
各7μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行RT-PCR:
过程 |
温度 |
时间 |
逆转录 |
42℃ |
30 min |
预变性 |
95℃ |
3 min |
RT-PCR反应 (45个循环) |
95℃ |
15 sec |
|
60℃ |
1 min(采集FAM通道的荧光信号) |
五、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于35。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。