Enteric Adenovirus肠道腺病毒41型探针法荧光定量PCR试剂盒

产品及特点

规格及成分

自备试剂 样品 DNA。

使用方法

一、稀释PCR 阳性对照（以10E1-10E6 拷贝/μL 这6个10倍稀释度为例）
如果做定性实验，则此步可以跳过。如果做定量实验，则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品只提供DNA片段作为阳性对照。
1.  标记6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液（ 用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入 5μL 1×10E7 拷贝/μL的阳性对照（试剂盒提供），充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入 5μL 1×10E6 拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入 5μL 1×10E5拷贝/μL的阳性对照（上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。
二、样品 DNA 的制备
7.如果有N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是样品制备 PC（样品制备阳性对照），一个是样品制备NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记 N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR 阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管中的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为描述操作步骤，
在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设 置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后 加）

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照管	标准曲线 样品管（1-6 管）
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各 10μL
肠道腺病毒41型探针法qPCR 引物混合液-探针混合液	3μL	3μL	各 3μL
N+2 个待测 DNA模板	7μL	不加	不加
超纯水	不加	7μL	不加
第 6 步所得标准曲线样品稀释液（1-6 号）	不加	不加	各7μL（1 号样到1 号管，2 号样到2 号管…）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5min
qPCR 反应 （40 个循环）	95℃	15sec
	60℃	1min（采集 FAM 通道的荧光信号）

四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 35。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。