His标签蛋白琼脂糖纯化树脂

中文名称：

His标签蛋白琼脂糖纯化树脂

英文名称：

Ni-NTA Agarose Resin

His标签蛋白琼脂糖纯化树脂产品规格：

10ml

发货周期：

1～3天

His标签蛋白琼脂糖纯化树脂

Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。
基质（Matrix）：高度交联的4%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165μm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.1MPa, 1bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
储存条件：4℃，有效期2年。


使用方法

（一）纯化流程

1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前*用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清0.22μm或0.45μm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3样品纯化

1）装柱：将Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4）上样：注意控制加样速度，确保目的蛋白与Ni2+充分接触，以提高纯化得率。
【注】：注意收集流出液，用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
5）平衡/洗杂：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。注意收集流出液。
【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）洗脱：使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7）清洗：依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】：建议在清洗之前用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8）保存：5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，*将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。*利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。


附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

附表3 Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况