pCold-SUMO表达系统

中文名称：

pCold-SUMO表达系统

英文名称：

pCold-SUMO expression system

pCold-SUMO表达系统产品规格：

1盒

发货周期：

1～3天

pCold-SUMO表达系统

本系统所包含的原核表达载体 pCold-SUMO 是在pCold载体基础上改造而成，该载体启动子(CS Promoter)来源于南极嗜冷细菌，在低温下(15 度)才能启动蛋白的表达。低温下细菌生长缓慢，使得蛋白合成速度减慢，从 而*限度的提高了蛋白正确折叠的几率，提高了蛋白可溶性表达，增强了活性蛋白的表达比率。该表达系统所包含的SUMO tag可以极大地提高小分子量蛋白的表达量，而且进一步提高了蛋白的可溶表达几率。同时，TEE 信号肽可增强冷启动子调控下目的蛋白的高表达。
BL21(DE3)Chaprone E.coli中含有分子伴侣蛋白质粒，其表达产物可协助重组蛋白正确折叠形成可溶活性蛋白。 分子伴侣蛋白质粒为氯霉素抗性（chloramphenicol，Cmr）的表达受控于四环素（tetR）操纵子。

本试剂盒配备的rTEV 蛋白酶可以识别SUMO 标签后面的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 氨基酸序列，并在识别位点 Gln-Gly 之间进行切割，从而去除SUMO标签。



产品组成：

产品特点：
·冷启动子，低温诱导表达，*限度地提高蛋白地可溶性；
·分子伴侣可协助蛋白的正确折叠；
·可大大的提高蛋白表达量；

pCold-SUMO-M 载体图谱： 


应用实例：

泳道2和3表明使用pET系统表达几乎无可溶性蛋白表达，皆为包涵体；泳道4和5表明使用pCold-SUMO系统于BL21(DE3)菌中，可溶性蛋白表达约占40%；泳道6和7表明使用BL21(DE3)chaprone可进一步提高蛋白的可溶性表达。
M.中分子量蛋白Marker,未诱导 
2.pET15b系统表达全菌体蛋白
3.pET15b系统表达上清液(可溶蛋白部分)
4.pCold-SUMO表达于BL21(DE3)全菌体蛋白
5.pCold-SUMO表达于BL21(DE3)上清液(可溶蛋白部分)
6.pCold-SUMO表达于BL21(DE3)chaprone全菌体蛋白
7.pCold-SUMO表达于BL21(DE3)chaprone上清液(可溶蛋白部分)
8.使用Ni-NTA Resin纯化SUMO融合蛋白
9.切除SUMO tag后的目的蛋白

保存条件：-20℃。

别名：pCold-SUMO原核蛋白表达试剂盒；pCold-SUMO表达试剂盒；pCold-SUMO载体表达系统

操作方法：

一、重组质粒构建
1．根据目的基因选择合适的酶切位点，将 pCold-SUMO-M 载体和插入片段分别进行双酶切，按如下反应进行双酶切反应（插入目的基因片段与载体相同）
? pCold-SUMO-M Vector（100ng/μl）——————10μl
? 内切酶反应Buffer（10×）——————————5μl
? 内切酶———————————————————15～10U
? 内切酶———————————————————25～10U
? ddH2O———————————————————-Up to 50μl
2．酶切完成后 经 1％琼脂糖凝胶电泳，将线性载体进行凝胶回收。
3．连接反应，反应体系如下：
? 酶切载体（20 ng/μl）———————————1μl
? 酶切目的基因片段（60 ng/μl）———————1μl
? 10×Ligation Buffer————————————1μl
? T4 DNA Ligase———————————————1μl
? ddH2O———————————————————2μl
4．取5μl连接产物转入 TOP10或DH5α 感受态细胞，通过测序鉴定重组质粒。
? 注：Sequencing Primers:
???pCold-SUMO Primer-F: 5’-CCCCTGAAGATTTGGACATG-3’
???pCold-SUMO Primer-R: 5’-TGGCAGGGATCTTAGATTCTG-3’
宿主表达菌的选择：通常使用pCold-SUMO 表达系统，在带有辅助折叠伴侣分子的BL21(DE3)Chaprone 宿主菌中可获得*的可溶表达。该系统在常规 BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS 等宿主菌内均可获得可观的可溶性表达。

二、重组蛋白表达于 BL21(DE3)Chaprone 宿主菌
? 注意：该试剂盒配备的RTS BL21(DE3)Chaprone 感受态为冻干粉感受态，可直接使用，效价约10⁴cfu/μg。
1．向0.2ml EP管中加入50μl E.coli Transfer Reagent，并加入2μl 构建的重组质粒（100ng），混合均匀，将混合液全部加入到一支 RTS BL21(DE3)Chaprone 感受态中吹打混合均匀，冰上放置 20分钟，42℃热激 45s，冰上放置 2分钟。将转化完毕的感受态吸入到一支装有 300μl LB或SOC 培养基的1.5ml EP管中，37℃摇床 220rpm 培养 60min。涂 150μl 于平板上（含 100μg/ml 氨苄青霉素，20μg/ml 氯霉素），37℃培养过夜。
2．挑选生长良好的菌落，接入 LB 培养基（含 100μg/ml 氨苄青霉素，20μg/ml 氯霉素），37℃剧烈振荡培养过夜。
3．1/50 比例接入新的LB 培养基（含 100μg/ml 氨苄青霉素，20μg/ml 氯霉素，0.5mg/ml L-阿拉伯糖）37℃剧烈振荡培养 2h。
4．加入终浓度 2ng/ml 四环素，37℃剧烈振荡培养至 OD600 约 0.5（约 2～4h）。
5．待培养基冷却至 15℃后，再静置 30分钟。
6．加入适量 IPTG(0.1-1 mM),15℃振荡培养24h。
7．4000 rpm 室温离心15分钟，收集细胞。
8．用重悬液重悬细胞，并置于冰上破碎。
9．破碎后使用SDS-PAGE 胶检测蛋白的表达及可溶性表达情况。
? 相关试剂配制：
? 1000×四环素（2μg/ml）：取0.2mg四环素盐酸盐（Sigma T3383），加入至100ml灭菌水中溶解。
? 1700×氯霉素（34mg/ml）：取340mg氯霉素（Sigma C0378），加入至 10ml乙醇中溶解。
? 200×L-阿拉伯糖（100mg/ml）：取1g L-阿拉伯糖（Sigma A3256），加入至10ml灭菌水中溶解。

三、重组蛋白表达于 BL21(DE3)宿主菌
1．将重组质粒转入表达宿主菌 BL21(DE3)感受态细胞（含 100μg/ml 氨苄青霉素）。
2．挑选生长良好的菌落，接入 LB 培养基（含 40-100μg/ml 氨苄青霉素），37℃剧烈振荡培养至 OD600=0.4-0.6。
4．待培养基冷却至 15℃后，再静置 30分钟。
5．加入适量 IPTG(0.1-1 mM),15℃振荡培养 24h。
6．4000 rpm 室温离心15分钟，收集细胞。
7．用重悬液重悬细胞，并置于冰上破碎。
8．破碎后使用SDS-PAGE 胶检测蛋白的表达及可溶性表达情况。

四、蛋白纯化
1．融合 SUMO 标签的重组蛋白含有 6×His 标签，重组蛋白可通过 Ni-NTA Resin(Biorab, MT0081)进行纯化。详细的纯化操作步骤请参考我司 Ni-NTA Resin(货号：MT0081)说明书。
2．使用rTEV 蛋白酶切割融合蛋白
由于 SUMO 蛋白酶识别 SUMO 标签的结构，有时候 SUMO 标签的结构受到重组蛋白的影响，酶切效率低，因此建议采用rTEV 蛋白酶来切除SUMO 标签【特异性识别 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 七氨基酸序列，剪切位点在Gln-Gly 之间】。切割后 SUMO 标签含 6×His 标签、目的蛋白不含有 6×His 标签，所以可通过 Ni-NTA Resin 将 SUMO 标签和未完全切割的融合蛋白与不含 SUMO 标签的目的蛋白分离纯化。本 rTEV蛋白酶（(货号：MT0083)）蛋白分子量为 30KD,并含有 6×His标签可通过 Ni-NTA Resin 去除。
? ① 在EP管中配制如下反应体系
???融合蛋白———————————20μg
???20×rTEV Buffer ———————7.5μl
???0.1M DTT———————————1.5μl
???rTEV Protease————————1～3μl
???ddH20————————————Up to 150μl
? ② 30℃孵育，在1、2、4、6 小时分别吸出 30μl上述反应液，置于单独的EP管中。
? ③ 向上述EP管中加入30μl 2×SDS Loading Buffer，置于-20℃。
? ④ 样品全部反应完毕后，样品煮沸 5 min，取40μl 进行 SDS-PAGE 分析。
? ⑤ 如融合蛋白要求低温处理，可将反应液置于 4℃，请延长反应时间，并增加 rTEV 酶用量