2×ligation solution MasterMix

中文名称：

2×ligation solution MasterMix

英文名称：

2×ligation solution MasterMix产品规格：

150μl

发货周期：

1～3天

2×ligation solution MasterMix

2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，实验时，只需加入片段和载体即可进行连接反应。适用于DNA片段和载体DNA的连接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。按照10μl连接体系计算，每次使用5μl，可以使用30次。
注意事项
1、2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中彻底融化，混匀后使用。
2、为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。

使用方法：
一、DNA片段和载体DNA的连接
(1)粘性末端的连接
1．反应体系：

注意：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1～1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng(0.025pmol)，10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意：
a.若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。
b.若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。
(2)平末端的连接
1、反应体系：

注意：
a.平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
b.载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng(0.025pmol)，10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意：
a.若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。
b.若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。

二、线性DNA的自身环化
1、反应体系：

2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意：若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

三、接头连接
1、反应体系：

2、彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件：16℃孵育30分钟。
4、65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。

储存条件：-20℃