柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)

中文名称：

柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)

英文名称：

Animal mitochondrial DNA column extraction kit(Sequencing Grade)

产品规格：

15次

发货周期：

1～3天

柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)

本试剂盒就是基于先纯化动物细胞线粒体、再从中柱式法纯化其DNA的两步法试剂盒。
试剂盒特点：
1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2. 两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，有粗提(mtDNA纯化前不用DNase处理线粒体)和精提(mtDNA纯化前用DNase处理线粒体)两套操作方案，适合于各种要求不同的后续实验。
3. 本产品一次可以处理约107×108个培养细胞，10mg培养细胞(相当于5瓶150 mm培养细胞)可以纯化到到0.2-0.5mg线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)试剂盒组成：

储存条件：常温运输和保存，保存期限一年。

柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一：线粒体粗提
1. 称25.4g蔗糖到225mL溶液A中，盖上盖子后充分摇晃3～5分钟溶解即得250mL溶液A工作液，放冰上预冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存，否则会长菌。
2. 如果是单层细胞，先用20mL PBS缓冲液洗涤107×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集107×108个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，*将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
3. 用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
4. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的溶液A工作液，轻柔重悬细胞。
5. 如果是成纤维细胞，由于其难于裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是，则直接进入下步操作。
6. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中(工作体积为10-15mL，间隙为0.12 mm，*是玻璃材质，否则线粒体产率会降低)匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前*先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3μl匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20-50%以下为佳。
7. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
8.转移上清液到离心管中，冰上放置待用。如有必要，可在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴上清液到载玻片上，再滴入50μl詹纳斯染液染色20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
9. 用固定角度转子(fixed-angle rotor)离心机4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
10. 用5mL溶液A工作液洗涤2次得线粒体粗提液(即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清)。
11. 如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第3部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。
12. 如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。

二：线粒体粗提液中细胞核DNA的去除及鉴定
13. 将线粒体重悬于0.3mL溶液A工作液中，取10μl作为未处理对照。
14. 加入6μl Benzonase(1U/μL)溶液和30μl DNase A溶液(配法：将0.5mL溶液B加到装有1mg DNase A干粉的离心管中得到2mg/mL溶液，未用完的部分需要分装后放-20℃保存)。
15. 37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：*先预实验，每隔一段时间取10μl样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增1-4个自选的VNTR位点和1-2个mtDNA基因(如vis或COII基因)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为*。可从本公司另购细胞核基因和线粒体基因专一性引物。
16. 加入10μl自备的0.5M EDTA溶液(pH8.0)以终止酶反应。显微镜下检查线粒体完整性(见上节第8步)。
17. 用固定角度转子离心机4℃10000 g离心10分钟，弃上清。
18. 用1mL的溶液A工作液洗涤沉淀(即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清。此为一次洗涤。)2次得到线粒体沉淀。

三：线粒体DNA提取
19.在不超过100μl的线粒体沉淀中加入600μl预热的溶液C到沉淀中，充分吹打均匀。
20. 再加入150μl(可称150-160mg)预热的溶液D到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
21. 65℃放置3～5分钟。
22. 加入200μl自备氯仿，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。
23. 12000～15000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
24. 加入1.5倍体积的溶液E，颠倒混匀后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。
25. 12000rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
26. 通用洗柱液洗涤2次(将0.5mL加入离心柱中，12000rpm室温离心1分钟，弃穿透液，此为洗涤一次，再重复一次)。
27. 空甩半分钟去除残留液体,将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
28. 加30-50μl DNA 洗脱液，室温放置3～5分钟。
29. 12000rpm室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液。