DNaseⅠ溶液(1mg/ml)常见的DNA与RNA提取方法

第一部分:基因组DNA 的提取及常见的问题

第二部分: RNA的提取及常见的问题

基因组DNA的用途：

DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象.为了进行测序,杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提.

基因组DNA提取的原则：

1、保证提取的DNA具有一定的长度

2、纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质

3、排除有机溶剂和金属离子的污染

4、蛋白质,多糖,脂类等降低到*程度

5、排除其他核酸分子的污染

DNaseⅠ溶液(1mg/ml)原因对策：

重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质，重新沉淀DNA,让酒精充分挥发

增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA，问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应.DNA提取常见问题，材料不新鲜或反复冻融，未很好抑制内源核酸酶的活性

提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断，外源核酸酶污染，反复冻融。

原因对策：

尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液，在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔，所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌，将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。

问题二:DNA降解.DNA提取常见问题;实验材料不佳或量少;破壁或裂解不充分;吸附或沉淀不;完全;洗涤时DNA丢失.

原因对策：

尽量选用新鲜(幼嫩)的材料

动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量).增加吸附的时间,或低温沉淀，小心操作

DNaseⅠ溶液(1mg/ml)问题三:DNA提取量少.

第一部分:基因组DNA 的提取

第二部分:RNA的提取及常见的

分离提纯RNA 的目的

分析不同发育时期基因的表达状况

获得新基因

研究基因的拼接

分析相应的蛋白产物

RNA的不稳定性

由于核糖残基的2'和3'位置带有羟基,RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量丰富,加热后仍能够正确折叠恢复活性,不易失活

提取RNA的注意事项

预防RNase污染,应注意以下几方面:

经常更换新手套.因为皮肤和实验室用品上可能有RNase,会导致RNase污染.

使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染.

应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase.

常用RNA酶抑制剂

焦磷酸二乙酯(DEPC): 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 .

异硫氰酸胍:目前是*的RNA酶抑制剂,裂解组织的同时也使RNA酶失活.既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用.

氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性.

RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白.RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活.

其它:SDS,尿素,硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用.

DNaseⅠ溶液(1mg/ml)组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清,消化系统的组织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理.

对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻,或投入专门的RNA样品储存液中保存.

液氮研磨时不要使液氮挥发净,随时补充;加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆.RNA的提取，杂质的抽提，采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀，离心分离两相时,应保证一定的转速和时间,使蛋白质,多糖和DNA分布到中间层和有机相中,RNA留在水相中，对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层,可以再次用有机溶剂抽提。

RNA的提取

RNA的沉淀和溶解

含RNA的水相过吸附柱,通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀,70%乙醇洗涤,晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA样品收集后或需长期保存时应置于-70℃ 或加入RNase抑制剂,分装使用，RNA的提取，RNA的检测，电泳槽系统的处理。

RNA提取常见问题：

1 抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染

2 DNA 的污染

3 离子浓度较高

原因对策：

1 保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心;增加有机溶剂抽提的次数,用吸附柱纯化

2 减少处理样品的量;加入不含RNase的DNase处理;再次纯化

3 增加漂洗次数

问题一: RNA样品不纯

RNA提取常见问题

1 样品含有杂质杂液

2 样品过量或样品裂解和匀浆不彻底

3 RNA未有效的吸附沉淀或洗脱

4 样品RNA含量少

原因对策：

1 去除样品中的杂质,离心除净样品中的培养基或储存液

2 减少样品用量;充分研磨样品,增加裂解液的用量和裂解的时间

3 延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间;再次洗脱

4 重复吸附,加入肝糖等有助RNA沉淀的试剂

问题二: RNA得率低

RNA提取常见问题

1 样品不新鲜或样品保存不当,RNA降解

2 污染了RNase

3 样品储存不当

原因对策：

1 尽量取新鲜的样品;取样后立即放入液氮保存;或放入专门的储存液内;研磨样品及时补充液氮

2 认真地处理相应的器具和试剂;严格地操作

3 -70℃ 冻存,分装使用;加入RNase抑制剂